HRMS-Massenspektrometrie

Gaschromatographie gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS)

Hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS = high resolution mass spectrometry)

Um den Nachweis anaboler Steroide weiter zu verbessern, wurde in den 90er Jahren die Hochauflösende Massenspektrometrie für den Routineeinsatz als Screeningmethode eingeführt.

Abb.1 zeigt das Screeningresultat für den Metandienonmetaboliten 9 (s.Abb.9, Anabolika-Nachweis), wobei mit einer Auflösung von R = 3000 auf zwei intensive Ionen (Massenspektrum s. Abb.11) empfindlich gescreent wird. Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass sie eine höhere Empfindlichkeit als die GC/MS mit niedriger Auflösung aufweist, und dass sie bei einer erhöhten Auflösung mit einer verbesserten Selektivität den biologischen Untergrund aus der mitisolierten Matrix deutlich reduziert. Dadurch wird das Signal-Rausch-Verhältnis und damit der Nachweis einer Verbindung deutlich verbessert [1].

Voraussetzung für HRMS: Atommassen keine ganzzahligen Werte

Die Voraussetzung für die Anwendung der Hochauflösenden Massenspektrometrie ist die Tatsache, dass die genauen Atommassen keine ganzzahligen Werte sind. Laut Konvention hat nur Kohlenstoff die Masse 12 während Wasserstoff die genaue Masse 1.007825, Stickstoff die Masse 14.003074 und Sauerstoff die Masse 15.994914. Diese Massen sollten nicht verwechselt werden mit den durchschnittlichen Atomgewichten, wobei der Anteil der natürlichen Isotope mitberechnet wird.

Abb.1A GC/HRMS-Chromatogramm (Auflösung R=3000) Screening-probe für den Metandienonmetaboliten 17ß-Methyl-5ß-androst-1-en-3α,17α-diol (1) als bis-TMS-Derivat mit den Ionen m/e 448.3192(M+) und m/e 358.2692(M+ -90, M+ - Si(CH3)3OH) mit 2 ng/ml Urin. Gerät: MS: Finnigan MAT 95, GC: Hewlett-Packard 5890, Säule: Hewlett-Packard, Ultra1, 17m, I.D. 0.2mm, Filmdicke 0.11µm, Trägergas: Helium 1 ml/min split 1:20, Temperaturprogramm: 185°C - 5°C/min - 240°C. 1B) Aufnahme mit einem normal auflösendem Massenspektrometer

Das folgende Beispiel zeigt wie zwei unterschiedliche Massenfragmente, die beide die gleiche Masse von 58 aufweisen, mit der Hochauflösung getrennt werden können:

Fragment	Masse	genaue Masse
C₃H₆O	58	58,041864
C₃H₈N	58	58,065674

Berechnung der Auflösung R
R = m / Δm = 58,05 / (58,065674-58,041864) = 2436

Eine Trennung dieser beiden Fragmente ist mit einer Auflösung von etwa 2500 möglich. Dieses bedeutet veranschaulicht, dass mit einer Auflösungseinstellung von 2500 und einer Messung mit der Masse m/e 58,0419 für Fragment 1, keine Signal für eine vorhandene Verbindung mit der Masse m/e 58,0657 für Fragment 2 , das nur einen Unterschied von 0,024 Massen aufweist, angezeigt wird.
Mit dieser Technik wurden 1995 im Kölner Labor bei Routinekontrollen für internationale Sportverbände (vor allem des Internationalen Gewichtheber-Verbandes) 65 positive Fälle zusätzlich festgestellt, die sonst unentdeckt geblieben wären.

Die Identifizierung der verdächtigen Proben erfolgt dann nach weitergehenden Isolierungsmethoden, so dass ein eindeutiges Massenspektrum registriert werden kann. Hierbei können zur Zeit je nach Verbindung Nachweisgrenzen bis zu 100 pg/ml Urin erreicht werden.

Literatur

[1] Schänzer W, Delahaut P, Geyer H, Machnik M, Horning S: Long-term detection and identification of metandienone and stanozolol abuse in athletes by gas chromatography- high-resolution mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Appl, 687(1) (1996) 93 108.

Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS)

Mit den derzeit im Institut eingesetzten hochauflösenden Massenspektrometern können Auflösungen (R) von bis zu R=240 000 unter Verwendung der Orbitrap-Technologie bzw. R=40 000 beim Einsatz von Flugzeitmassenspektrometern (TOF) erzielt werden. Beide Technologien sind prinzipiell koppelbar mit der Flüssigkeits- aber auch Gas-Chromatographie und bieten die Möglichkeit von Fragmentierungsexperimenten (Tandem-Massenspektrometrie).

Die hohe Auflösung (z.B. R=240 000) ermöglicht theoretisch eine Unterscheidung von Molekülen mit der Masse 240 000 Da von 240 001 Da,

24 000,0 Da von 24 000,1 Da,

2400,00 Da von 2400,01 Da oder

240,000 Da von 240,001 Da.

Praktisch kann dies besonders bei der Analyse von intakten Proteinen hilfreich sein, um diese eingehend zu charakterisieren. Abb. 2 eigt hierzu das Spektrum eines bis dahin unbekannten Fusionsproteins, welches in einem beschlagnahmten Schwarzmarktprodukt identifiziert wurde.

Abb. 2: HRMS-Spektrum (R= 240 000 @m/z 200, gemessen auf einem Thermo Q Exacive HF mittels Elektrospray-Ionisation) eines intakt gemessenen Fusionsproteins mit der akkurat ermittelten monoisotopischen Masse von 17931,84 Da. Erkennbar ist das charakteristische Isotopenmuster des 21-fach protonierten Vorläuferions bei m/z=854,91 [2]

Aber auch für die exakte Molekülmassenbestimmung und der sich daraus ergebenen Summenformel für kleinere Moleküle (wie z. B. anabole Steroide, Stimulanzien etc.) ist die HRMS bestens geeignet. So gibt es beispielsweise für eine gemessenes Masse-zu-Ladungsverhältnis von m/z = 329,2587 bei einem erlaubten Messfehler-Intervall von 2 ppm (parts per million) unter Berücksichtigung der Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff, nur eine mögliche Summenformel C₂₁H₃₃ON₂ (Stanozolol). Bei 5 ppm sind es 2 (C₂₁H₃₃ON₂, C₁₉H₃₁N₅), bei 10 ppm sind es 3 (C₂₁H₃₃O N₂, C19H₃₁N₅, C₁₈H₃₅O₄ N) und bei 20 ppm sind es 6 (C₂₁H₃₃ON₂, C₁₉H₃₁N₅, C₁₈H₃₅O₄N, C₁₆H₃₃O₃N₄, C₁₄H₃₁O₂N₇, C₁₃H₃₁ON₉) mögliche Summenformeln. Die heutzutage eingesetzten HRMS-Systeme sind nach geeigneter Kalibrierung in der Lage ein Messfehler-Intervall von 1-5 ppm zu erreichen. Hochaufgelöste massenspektrometrische Daten enthalten demnach eine sehr hohe Informationsdichte, die es prinzipiell auch erlauben, eine retrospektive Datenevaluierung durchzuführen und damit Messungen noch Jahre nach der Analyse erneut auf bis dato unbekannte Substanzen zu untersuchen [3, 4]. Die endgültige Identifizierung von verbotenen Substanzen wird jedoch auch immer noch unter Berücksichtigung der Retentionszeit und charakteristischen Produktionen im Vergleich zur jeweiligen Referenzsubstanz erfolgen.
^{_{(20.11.2017 Andreas Thomas)}}

Literatur

[2] Walpurgis, K., Krug, O., Thomas, A., Laussmann, T., Schänzer, W., Thevis, M.: Detection of an unknown fusion protein in confiscated black market products. Drug Test Anal (2014) 6: 1117-24.

[3] Görgens, C., Guddat, S., Thomas, A., Wachsmuth, P., Orlovius, A. K., Sigmund, G., Thevis, M., Schänzer, W.: Simplifying and expanding analytical capabilities for various classes of doping agents by means of direct urine injection high performance liquid chromatography high resolution/high accuracy mass spectrometry. J Pharm Biomed Anal (2016) 131: 482-96.

[4] Thomas, A., Guddat, S., Kohler, M., Krug, O., Schänzer, W., Petrou, M., Thevis, M.: Comprehensive plasma-screening for known and unknown substances in doping controls. Rapid Commun Mass Spectrom (2010) 24: 1124-32.