Isotopen-Bestimmung

Isotopenverhältnis-Massenspektrometerie des Kohlenstoffs
(Gaschromatographie/Combustion/ Isotope Ratio Mass Spektrometry - GC/C/IRMS)

Das Testostern-Nachweisverfahren, das relativ aufwendig und zudem nur eine indirekte Methode darstellt, wird seit Ende der 90er Jahre durch ein direktes Bestimmungsverfahren mittels der ¹³C/¹²C -Isotopen-Massenspektrometrie abgesichert [10-12]. Die ¹³C/¹²C-Isotopen-Massenspektrometrie ermöglicht einen eindeutigen Nachweis von Doping mit endogenen Steroidhormonen wie Testosteron, Dihydrotestosteron und Dehydroepiandrosteron. Das ¹³C/¹²C -Isotopenverhältnis synthetischer Steroidhormone, die z.T. aus pflanzlichen Vorläufern isoliert und chemisch verändert werden, unterscheidet sich deutlich von dem der im Körper synthetisierten Hormone.

Körpereigene Hormone und ihre Hauptmetaboliten isoliert und gaschromatographiert 

Für diese Methode werden die körpereigenen Hormone sowie ihre Hauptmetaboliten isoliert und gaschromatographiert. Nach der GC-Trennung werden die Hormone vollständig in einer Oxidationskammer katalytisch zu CO₂ umgesetzt (combustion = Verbrennung) und anschließend in einem Massenspektrometer bestimmt. Hierbei werden lediglich die Massen m/e 44 für ¹²CO₂, m/e 45 für ¹³CO₂ und m/e 46 für ¹²C¹⁸O¹⁶O benötigt (m/e 46 wird für die Korrektur von m/e 45 berechnet, das auch aus ¹²C¹⁷O¹⁶O gebildet wird). Mit dieser Methode kann das ¹³C/¹²C-Verhältnis, das natürlich bei ca. 1,11% (¹²C 98,89%, ¹³C 1,11%) liegt, auf 0.0002% genau bestimmt werden.

Die gemessenen Isotopenverhältnisse werden dabei in promill [d ¹³C(‰)] zu dem Isotopenverhältnis eines geeichten CO₂-Gases angegeben. Die Reproduzierbarkeit der Messungen liegt z.B. bei einem Wert von -24,4 ‰ bei +/- 0,2 ‰. In Abb.15 ist das Ergebnis der ¹³C/¹²C-Isotopen-Bestimmung von körpereigenen Steroidhormonen anhand einer positiven Testosteronprobe im Vergleich zu einer Urinprobe während einer endokrinologischen Studie des gleichen Athleten zusammenfassend dargestellt. Dabei wird anhand des Syntheseweges von Testosteron deutlich, dass Vorläufer im Stoffwechsel von Testosteron wie Cholesteron oder Pregnenolon sowohl bei der positiven als auch bei der normalen Probe keine Veränderung zeigen. Dagegen zeigen bei der positiven Probe Testosteron als auch dessen Metaboliten Androsteron und Etiocholanolon eindeutig negativere Werte, die vergleichbar zu den Werten synthetischer Testosteronprodukte (-28 bis -31 ‰) sind.

[10] Brand WA: High precision isotope ratio monitoring techniques in mass spectrometry. J Mass Spectrom, 31(3) (1996) 225 35.
[11] Becchi M, Aguilera R, Farizon Y, Flament MM, Casabianca H, James P: Gas chromatography/ combustion/isotope-ratio mass spectrometry analysis of urinary steroids to detect misuse of testosterone in sport. Rapid Commun Mass Spektrom, 8(4) (1994) 304 8.
[12] Horning S, Geyer H, Machnik M, Schänzer W, Hilkert H, Oeßelmann J: Detection of exogenous testosterone ¹³C/¹²C analyiss. In: Schänzer W, Geyer H, Gotzmann A, Mareck-Engelke U (eds.), Recent advances in doping analysis (4). Sport und Buch Strauß, Köln , (1997) 275-284.